STAR Protocols丨湯常永團(tuán)隊(duì)發(fā)表基于慢病毒調(diào)控基因表達(dá)評(píng)估成年嚙齒動(dòng)物神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知功能的實(shí)驗(yàn)方案
成體神經(jīng)發(fā)生是神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells, NSCs）產(chǎn)生功能性新生神經(jīng)元的過程，其主要發(fā)生在海馬齒狀回(Dentate gyrus, DG)的顆粒細(xì)胞層下區(qū)和側(cè)腦室下區(qū)[1]。其中，成體海馬神經(jīng)發(fā)生（Adult hippocampal neurogenesis, AHN）異常被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)精神性疾病認(rèn)知功能障礙關(guān)鍵因素[1-2]。目前，各種研究成體神經(jīng)發(fā)生異常的分子機(jī)制方法迥異，不能統(tǒng)一評(píng)估和有效復(fù)制；因此，急需建立一套相對(duì)完整、高效和簡(jiǎn)潔的標(biāo)準(zhǔn)化研究方案。
2023年11月28日，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱：中山三院）湯常永團(tuán)隊(duì)受邀在Cell子刊STAR Protocols在線發(fā)表了題為“Protocol for lentivirus-mediated delivery of genes to study neurogenesis and cognitive function in adult rodents”的實(shí)驗(yàn)方案文章（Protocol）。該文章展示了一套相對(duì)完整的實(shí)驗(yàn)流程，包括構(gòu)建包裝含有目標(biāo)基因（多效生長(zhǎng)因子[Pleiotrophin, PTN]）的慢病毒，利用腦立體定位注射技術(shù)向海馬齒狀回注射慢病毒，評(píng)估海馬成體神經(jīng)發(fā)生，以及實(shí)施認(rèn)知功能相關(guān)行為學(xué)測(cè)試。這一實(shí)驗(yàn)流程為該領(lǐng)域科研人員研究AHN的分子機(jī)制提供一種簡(jiǎn)潔且系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方案。此前，湯常永團(tuán)隊(duì)已運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了衰老相關(guān)的海馬神經(jīng)發(fā)生衰退及相關(guān)認(rèn)知功能障礙分子機(jī)理的研究，相關(guān)研究成果發(fā)表于Cell Reports?(2023)[3]。
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△原文鏈接?https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102761
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參考文獻(xiàn)
1.Li, Y., et al. Neural Stem Cell Niche and Adult Neurogenesis. Neuroscientist. 2021; 27: 235–245.
2.Anacker, C., et al. Adult hippocampal neurogenesis and cognitive flexibility - linking memory and mood. Nat. Rev. Neurosci. 2017; 18: 335–346.
3.Li H, et al. Pleiotrophin ameliorates age-induced adult hippocampal neurogenesis decline and cognitive dysfunction. Cell Rep. 2023;42(9):113022.
論文梗概
在本研究方案中，作者以PTN為例，詳細(xì)闡述了PTN過表達(dá)慢病毒構(gòu)建、海馬DG區(qū)立體定位注射、神經(jīng)發(fā)生評(píng)估（EdU和BrdU注射）、組織免疫熒光處理和認(rèn)知行為學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)流程（圖1）。
△圖1：神經(jīng)發(fā)生相關(guān)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方案流程圖（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
作者首先詳細(xì)描述了過表達(dá)PTN慢病毒的構(gòu)建方法，即：使用目標(biāo)質(zhì)粒CAG-PTN-2A-GFP和3個(gè)包裝質(zhì)粒（VSVG，pMDLg和pRSV-Rev）按一定比例混合后，利用轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（Polyethylenimine， PEI)，以HEK293T細(xì)胞為媒介，依次通過連續(xù)收集含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)基上清、負(fù)壓過濾、超速離心、病毒滴度測(cè)定等步驟，構(gòu)建過表達(dá)PTN的高滴度慢病毒（圖2）。
△圖2：過表達(dá)PTN慢病毒構(gòu)建示意圖（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
然后，通過查閱相關(guān)資料，確定小鼠海馬DG區(qū)坐標(biāo)：以前囟為0點(diǎn)，向后2.0 mm，中線旁開1.7 mm，深度1.9 mm；利用小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)對(duì)老年小鼠（12月齡）進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉和維持麻醉，再將小鼠固定于操作臺(tái)，剔除頭部毛發(fā)后使用數(shù)字化立體定位儀標(biāo)記坐標(biāo)；完成以上術(shù)前準(zhǔn)備后，使用顱鉆打孔，通過顯微注射器勻速注入慢病毒后留針5分鐘，接著縫合傷口完成整個(gè)海馬DG區(qū)的病毒注射；最后將術(shù)后小鼠置于小動(dòng)物電熱毯進(jìn)行麻醉復(fù)蘇，密切關(guān)注小鼠生命體征，待小鼠舒醒后，放回干凈鼠籠（圖3）。
△圖3：成年小鼠海馬齒狀回慢病毒立體定位注射的主要手術(shù)器械和關(guān)鍵步驟（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
接著，將一批老年小鼠在術(shù)后1周取材前2小時(shí)進(jìn)行腹腔注射EdU，從而標(biāo)記具有增殖能力的NSCs，以評(píng)估過表達(dá)PTN對(duì)NSCs增殖能力（GFP+EDU+GFAP+細(xì)胞）的影響。同時(shí)，手術(shù)3天后對(duì)另一批老年小鼠進(jìn)行連續(xù)4天的腹腔注射BrdU來標(biāo)記NSCs，然后分別在第2周末和第4周末對(duì)小鼠進(jìn)行取材，通過組織免疫熒光染色對(duì)比過表達(dá)PTN組小鼠和對(duì)照組小鼠海馬區(qū)的新生未成熟神經(jīng)元（GFP+BrdU+DCX+細(xì)胞）和新生神經(jīng)元（GFP+BrdU+NeuN+細(xì)胞）的數(shù)量，進(jìn)而反映過表達(dá)PTN能夠提高NSCs向神經(jīng)元分化的潛能（圖4）。
△圖4：PTN能夠促進(jìn)成年小鼠海馬區(qū)NSCs的增殖和神經(jīng)元向分化（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
最后，在術(shù)后4周時(shí)，對(duì)2組剩余的老年小鼠進(jìn)行認(rèn)知功能相關(guān)行為學(xué)測(cè)試，包括傳統(tǒng)水迷宮（Morris Water Maze, MWM）實(shí)驗(yàn)和反向水迷宮（Reverse Morris Water Maze, RMWM）實(shí)驗(yàn)，分別比較2組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期和穿越目標(biāo)象限的次數(shù)；結(jié)果表明，過表達(dá)PTN組的小鼠總體表現(xiàn)更好，提示PTN能夠改善老年小鼠的認(rèn)知功能減退（圖5）。
△圖5：PTN能夠改善年齡相關(guān)的認(rèn)知功能減退（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
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結(jié)論與討論
綜上所述，在這項(xiàng)工作中，作者詳細(xì)描述了一套評(píng)估動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)流程。通過構(gòu)建載運(yùn)目標(biāo)基因的慢病毒，靶向海馬DG區(qū)進(jìn)行立體定位注射，借助EdU和BrdU方法標(biāo)記NSCs，利用免疫熒光檢測(cè)海馬DG區(qū)組織等有效評(píng)估了特定基因?qū)HN的關(guān)鍵作用；同時(shí)，輔以行為學(xué)測(cè)試，進(jìn)一步從功能學(xué)層面揭示了目標(biāo)基因的具體影響。該方法有利于全面評(píng)估AHN，為研究AHN的分子機(jī)制提供了標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方案。
研究團(tuán)隊(duì)
中山三院徐莉博士研究生為本文第一作者，湯常永為通訊作者；該研究得到了中山三院李浩洋、姜維、徐輝明等同學(xué)的幫助。此外，該研究得到了中山三院神經(jīng)內(nèi)科陸正齊、邱偉，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)部韓曉燕及丘秀生等教授的支持和幫助。
△照片提供自湯常永團(tuán)隊(duì)
通訊作者簡(jiǎn)介：湯常永，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院副研究員，中山大學(xué)“百人計(jì)劃”引進(jìn)人才。2019年畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所并獲得神經(jīng)生物學(xué)專業(yè)博士學(xué)位，布朗大學(xué)博士后。曾獲得北京市優(yōu)秀畢業(yè)生、中科院優(yōu)秀畢業(yè)生、中科院院長(zhǎng)優(yōu)秀獎(jiǎng)等獎(jiǎng)勵(lì)。主要研究神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞及其微環(huán)境在神經(jīng)退行性疾?。ㄈ缢ダ?、AD等）和神經(jīng)免疫性疾?。ㄈ鏝MOSD、MS等）中的作用。近年來在Science Advance?(2023)，Molecular Therapy?(2023)，Cell reports?(2023, 2019)，Neuron?(2019)，Molecular Psychiatry?(2021)，Glia?(2022),?STAR Protocols?(2020, 2023)等雜志發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文，并主持國(guó)家自然基金、科技創(chuàng)新-2030腦計(jì)劃青年項(xiàng)目（課題骨干）、廣州市基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)科學(xué)基金等多個(gè)科研項(xiàng)目。
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