【中心科研】Nat Commun | 中山三院腦病中心聯(lián)合香港中文大學(xué)揭示多發(fā)性硬化髓鞘再生障礙新機(jī)制

多發(fā)性硬化（MS）是西方人群最為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一（>1/10000患病率），而東方人群相對(duì)少見(jiàn)（<1/10萬(wàn)患病率），2018年中國(guó)官方將其列為罕見(jiàn)病。作為一種經(jīng)典的免疫介導(dǎo)的脫髓鞘疾病，MS病理機(jī)制為有髓神經(jīng)纖維的髓鞘遭受了持久且嚴(yán)重的免疫攻擊。正常情況下，機(jī)體具備自我修復(fù)功能，能夠促使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞并生產(chǎn)髓鞘從而修復(fù)損傷；然而在慢性病程中，髓鞘再生過(guò)程常受阻礙，導(dǎo)致MS患者病情惡化進(jìn)展。

MS目前無(wú)治愈方法，治療主要集中在免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域，但仍不能有效阻斷疾病進(jìn)展。近年，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不同膠質(zhì)細(xì)胞相互作用成為研究熱點(diǎn)，它也可能是影響MS患者OPC分化的關(guān)鍵因素之一。因此，該研究探討MS患者膠質(zhì)細(xì)胞間相互作用的機(jī)制，從而開發(fā)新的MS治療靶點(diǎn)。

1、臨床數(shù)據(jù)顯示CLU在MS患者及動(dòng)物模型腦組織中表達(dá)

MS患者標(biāo)本結(jié)合已公開發(fā)表的測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）在活躍的病灶區(qū)域呈現(xiàn)顯著的Clusterin（CLU）高表達(dá)。免疫熒光揭示，CLU主要與GFAP⁺AST細(xì)胞共定位，且在活動(dòng)性病灶區(qū)域。另外，在MS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ虴AE中，小膠質(zhì)細(xì)胞（IBA1⁺）、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體（OPC，PDGFRa⁺）、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（CC1⁺）、神經(jīng)元（NeuN⁺）以及血管內(nèi)皮細(xì)胞（CD31⁺）中均未檢測(cè)到CLU表達(dá)信號(hào)。同時(shí)，在EAE模型和LPC誘導(dǎo)的脫髓鞘模型的病灶中，也觀察到AST細(xì)胞CLU表達(dá)上調(diào)。最后，EAE中CLU表達(dá)水平與EAE殘疾評(píng)分存在顯著相關(guān)。然而，在銅腙誘導(dǎo)的非炎癥脫髓鞘模型中，并未出現(xiàn)CLU表達(dá)上調(diào)（圖1、圖2）。證明，CLU僅在“炎性”脫髓鞘環(huán)境下，且僅在AST細(xì)胞的特異性表達(dá)。

△圖1??CLU在MS和小鼠EAE模型中的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)水平升高

△圖2? 單細(xì)胞測(cè)序分析提示CLU在多發(fā)性硬化患者病灶中AST細(xì)胞中高表達(dá)

2、CLU可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片功能

通過(guò)RNAseq，研究人員探究了CLU對(duì)AST細(xì)胞增殖和功能影響。利用體外EDU增殖實(shí)驗(yàn)，研究人員成功驗(yàn)證了CLU對(duì)AST細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。體內(nèi)緩釋泵實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，CLU在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)能顯著增強(qiáng)GFAP⁺ALDH1L1⁺AST細(xì)胞的增殖能力。另一方面，髓鞘吞噬實(shí)驗(yàn)證明，CLU可抑制AST細(xì)胞的髓鞘吞噬功能。然而，對(duì)于另一類髓鞘碎片清除細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞，CLU對(duì)其吞噬功能無(wú)明顯影響（圖3）。因此，CLU在神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)AST起重要作用。

△圖3? CLU對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的影響

3、CLU可損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體OPC細(xì)胞并導(dǎo)致髓鞘缺失

通過(guò)RNAseq，研究人員對(duì)CLU刺激下少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，CLU在短時(shí)間內(nèi)（3h）即可顯著下調(diào)與OPC分化及髓鞘形成緊密相關(guān)的基因表達(dá)。GSEA中的GO注釋表明CLU對(duì)OPC的毒性作用，在“response to toxic substance”和“mitochondrial outer membrane permeabilization involved in programmed cell death”等過(guò)程中富集。在長(zhǎng)時(shí)間（24h）刺激后，研究人員發(fā)現(xiàn)CLU暴露與Pi3k-Akt信號(hào)通路抑制緊密相關(guān)。因此，CLU對(duì)OPC有作用，不僅導(dǎo)致其增殖和分化過(guò)程出現(xiàn)障礙，還能對(duì)其細(xì)胞功能造成損害。研究人員進(jìn)一步行體外刺激實(shí)驗(yàn)，證實(shí)CLU會(huì)導(dǎo)致OPC的分化與成熟異常，同時(shí)觀察到其增殖能力下降和凋亡率上升。

在器官型腦片實(shí)驗(yàn)中，研究人員也觀察到相同結(jié)果，證實(shí)CLU的負(fù)面效應(yīng)?；贜G2-CreERT2:: taumGFP報(bào)告小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯咳藛T觀察到外源性CLU的持續(xù)泵入會(huì)導(dǎo)致GFP⁺新生髓鞘減少，以及髓鞘厚度的顯著降低。此外，當(dāng)研究人員在AST細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)CLU（利用Cre-DIO系統(tǒng)）時(shí)，也觀察到相同結(jié)果，包括NG2^+?OPC和CC1⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的減少，以及CC3⁺凋亡細(xì)胞比例增加。電鏡也顯示局部髓鞘厚度變化。綜上所述，在病理狀態(tài)下，AST細(xì)胞所分泌的CLU會(huì)對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞造成損傷。然而，CLU對(duì)神經(jīng)軸索并未產(chǎn)生顯著影響（圖4-7）。

△圖4??RNAseq顯示CLU對(duì)OPC轉(zhuǎn)錄水平的影響

△圖5??CLU在體外對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞的影響

△圖6??不同時(shí)間點(diǎn)CLU在體外對(duì)于少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞的影響

△圖7??NG2-CreERT2:: taumGFP報(bào)告小鼠及CLU特異性過(guò)表達(dá)系統(tǒng)(Cre-DIO)提示星形膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的CLU對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞造成損傷

4、CLU對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體OPC細(xì)胞的損傷由VLDLR介導(dǎo)

通過(guò)對(duì)不同年齡階段小鼠大腦的研究，研究人員發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體OPC細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)VLDLR，而AST細(xì)胞則主要表達(dá)ApoER2受體。此外，在EAE和LPC脫髓鞘模型中，這些受體依然存在持續(xù)表達(dá)。因此，VLDLR在CLU誘導(dǎo)的OPC損傷中扮演核心角色。研究人員進(jìn)一步采用NG2啟動(dòng)子慢病毒介導(dǎo)的特異性敲低技術(shù)，針對(duì)NG2^+?OPC細(xì)胞中的VLDLR進(jìn)行敲低操作。結(jié)果表明，VLDLR敲低后，OPC中的EDU⁺細(xì)胞比例顯著增加，而CC3⁺細(xì)胞比例顯著降低。因此，VLDLR的減少可以有效緩解CLU對(duì)OPC的損傷作用（圖8-9）。

△圖8? 少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞在不同年齡段與不同模型中的VLDLR表達(dá)情況

△圖9 ?利用慢病毒特異性敲低NG2^+?OPC細(xì)胞VLDLR后可減輕CLU對(duì)OPC細(xì)胞的損傷

5、Pi3k-Akt通路是CLU誘導(dǎo)OPC損傷的重要機(jī)制

在體外實(shí)驗(yàn)中，研究人員通過(guò)測(cè)序揭示了CLU對(duì)Pi3k-Akt通路的抑制作用。隨后，研究人員采用緩釋泵系統(tǒng)為外源性CLU暴露小鼠分別注射了Akt激動(dòng)劑SC79與拮抗劑MK2206，并觀察到了顯著的生物學(xué)效應(yīng)。具體而言，SC79能夠部分逆轉(zhuǎn)由CLU暴露引起的NG2⁺/CC1⁺細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)降低了CC3⁺細(xì)胞比例；MK2206則加劇CLU對(duì)NG2^+?OPC細(xì)胞及CC1⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞的損害。因此，CLU通過(guò)抑制Pi3k-Akt通路，導(dǎo)致了少突膠質(zhì)細(xì)胞及OPC細(xì)胞的損傷（圖10）。

△圖10? CLU通過(guò)抑制Pi3k-Akt通路導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞損傷

6、CLU敲低與敲除可提高小鼠脫髓鞘病灶的髓鞘修復(fù)

利用攜帶shCLU的AAV，研究人員成功地敲低了小鼠胼胝體區(qū)的CLU表達(dá)，另外借助GfaABC1D啟動(dòng)子的AAV-Cre-EGFP特異性地敲除了CLU^fl/fl小鼠胼胝體區(qū)AST細(xì)胞的CLU。隨后，對(duì)這些小鼠行LPC脫髓鞘模型，結(jié)果顯示CLU敲低與敲除顯著提高了LPC脫髓鞘病灶區(qū)域內(nèi)OPC和OL細(xì)胞數(shù)量和髓鞘厚度。結(jié)果提示局部CLU表達(dá)的敲除對(duì)于LPC脫髓鞘病灶的髓鞘再生具有顯著的促進(jìn)作用。研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了ALDH1L1-CreERT::CLU^fl/fl條件敲除小鼠，并對(duì)其進(jìn)行EAE造模。結(jié)果顯示，條件敲除小鼠相較于對(duì)照組表現(xiàn)出較低的疾病發(fā)病水平，且其脊髓病灶中的OPC的凋亡現(xiàn)象有所緩解。此外，敲除小鼠病灶中IBA1⁺小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，提示AST細(xì)胞上CLU的敲除可能具有髓鞘保護(hù)效應(yīng)（圖11-14）。

△圖11? CLU敲低可增強(qiáng)LPC導(dǎo)致的胼胝體脫髓鞘病灶的髓鞘再生

△圖12? 敲低CLU可促進(jìn)LPC脫髓鞘病灶的髓鞘修復(fù)

△圖13? 敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞CLU可減輕EAE發(fā)病程度及病灶內(nèi)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的損傷

△圖14? 敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞的CLU可促進(jìn)LPC脫髓鞘病灶的髓鞘修復(fù)，減輕EAE脫髓鞘病灶中IBA1⁺細(xì)胞數(shù)量

△圖15? MS/EAE中星膠“發(fā)炎”，抑制髓鞘再生