Nat Commun|中山三院腦病中心聯(lián)合香港中文大學(xué)揭示多發(fā)性硬化髓鞘再生障礙新機(jī)制
近日，我院腦病中心邱偉團(tuán)隊聯(lián)合香港中文大學(xué)劉曉東團(tuán)隊在國際期刊Nature Communications（中科院一區(qū)）發(fā)表題為 “Astrocyte Derived Clusterin Disrupts Glial Physiology to Obstruct Remyelination in Mouse Models of Demyelinating Diseases”的研究論文。我院腦病中心陳晨博士、舒崖清副教授、言誠開博士后為共同第一作者；我院腦病中心邱偉教授、秦峰主任醫(yī)師，香港中文大學(xué)劉曉東教授為共同通訊作者。該研究得到了陸軍軍醫(yī)大學(xué)梅峰、海南省人民醫(yī)院黃仕雄、廣東三九腦科醫(yī)院王展航等專家的支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52142-7
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多發(fā)性硬化（MS）是西方人群最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一（>1/10000患病率），而東方人群相對少見（<1/10萬患病率），2018年中國官方將其列為罕見病。MS為一種經(jīng)典的免疫介導(dǎo)的脫髓鞘疾病。正常情況下，機(jī)體具備自我修復(fù)功能，能夠促使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞（OL）并生產(chǎn)髓鞘從而修復(fù)損傷；然而在慢性病程中，髓鞘再生過程常受阻礙，導(dǎo)致MS患者病情惡化進(jìn)展。
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1、CLU在MS患者及動物模型腦組織中表達(dá)
MS患者標(biāo)本結(jié)合已公開發(fā)表的測序數(shù)據(jù)顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）在活躍的病灶區(qū)域呈現(xiàn)顯著的Clusterin（CLU）高表達(dá)。另外，在EAE和LPC誘導(dǎo)的脫髓鞘模型病灶中，也觀察到AST細(xì)胞CLU表達(dá)上調(diào)。且EAE中CLU表達(dá)水平與EAE殘疾評分存在顯著相關(guān)。然而，在銅腙誘導(dǎo)的非炎癥脫髓鞘模型中，并未出現(xiàn)CLU表達(dá)上調(diào)。證明，CLU僅在“炎性”脫髓鞘環(huán)境中AST細(xì)胞的特異性上調(diào)（圖1、圖2）。
△圖1??CLU在MS和小鼠EAE模型中的AST中表達(dá)水平升高
△圖2? 單細(xì)胞測序分析提示CLU在多發(fā)性硬化患者病灶中AST細(xì)胞中高表達(dá)
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2、CLU可抑制AST細(xì)胞吞噬髓鞘碎片功能
通過RNAseq，研究人員探究了CLU對AST細(xì)胞增殖和功能影響。利用體內(nèi)、外增殖實(shí)驗(yàn)，研究人員成功驗(yàn)證了CLU對AST細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。另一方面，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CLU可抑制AST細(xì)胞的髓鞘吞噬功能（圖3）。因此，CLU在神經(jīng)系統(tǒng)中對AST起重要作用。
△圖3? CLU對AST和小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的影響
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3、CLU可損傷OL和OPC并導(dǎo)致髓鞘缺失
通過RNAseq，研究發(fā)現(xiàn) CLU在3h即可顯著下調(diào)與OPC分化及髓鞘形成緊密相關(guān)的基因表達(dá)。在24h刺激后， CLU暴露與Pi3k-Akt信號通路抑制緊密相關(guān)。研究人員進(jìn)一步行體外刺激實(shí)驗(yàn)，證實(shí)CLU會導(dǎo)致OPC的分化與成熟異常，同時觀察到其增殖能力下降和凋亡率上升。
基于NG2-CreERT2:: taumGFP報告小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究人員觀察到外源性CLU的持續(xù)泵入會導(dǎo)致GFP+新生髓鞘減少，以及髓鞘厚度的顯著降低。此外，利用Cre-DIO系統(tǒng)在AST過表達(dá)CLU后，也觀察到相同結(jié)果。綜上所述，在病理狀態(tài)下，AST分泌的CLU會對OPC和OL造成損傷（圖4、圖5）。
△圖4??RNAseq顯示CLU對OPC轉(zhuǎn)錄水平的影響
△圖5??NG2-CreERT2:: taumGFP報告小鼠及CLU特異性過表達(dá)系統(tǒng)(Cre-DIO)提示AST所分泌的CLU對OL和OPC造成損傷
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4、CLU對OL和OPC的損傷由VLDLR介導(dǎo)
研究發(fā)現(xiàn)OL和OPC持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)VLDLR，而AST細(xì)胞則主要表達(dá)ApoER2受體。研究人員進(jìn)一步采用NG2啟動子慢病毒介導(dǎo)的特異性敲低技術(shù)，針對NG2+?OPC細(xì)胞中的VLDLR進(jìn)行敲低操作。結(jié)果表明，VLDLR敲低后，OPC中的EDU+細(xì)胞比例顯著增加，而CC3+細(xì)胞比例顯著降低。因此，VLDLR的減少可以有效緩解CLU對OPC的損傷作用。
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5、Pi3k-Akt通路是CLU誘導(dǎo)OPC損傷的重要機(jī)制
在體外實(shí)驗(yàn)中，研究人員通過測序揭示CLU對Pi3k-Akt通路的抑制作用。隨后，通過采用緩釋泵系統(tǒng)為外源性CLU暴露小鼠分別注射了Akt激動劑SC79與拮抗劑MK2206。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SC79能夠部分逆轉(zhuǎn)由CLU暴露引起的OL和OPC數(shù)量減少；MK2206則加劇OL和OPC的損害。因此，CLU通過抑制Pi3k-Akt通路，導(dǎo)致了OL和OPC的損傷。
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6、CLU敲低與敲除可提高小鼠脫髓鞘病灶的髓鞘修復(fù)
利用攜帶shCLU的AAV敲低小鼠胼胝體區(qū)的CLU表達(dá)，或借助GfaABC1D-Cre-EGFP特異性地敲除CLUfl/fl小鼠胼胝體區(qū)AST細(xì)胞的CLU。隨后，對這些小鼠建立LPC脫髓鞘模型。結(jié)果顯示CLU敲低與敲除顯著提高了LPC脫髓鞘病灶區(qū)域內(nèi)OPC和OL細(xì)胞數(shù)量和髓鞘厚度。研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了ALDH1L1-CreERT::CLUfl/fl條件敲除小鼠，并進(jìn)行EAE造模。結(jié)果顯示，條件敲除小鼠相較于對照組表現(xiàn)出較低的疾病發(fā)病水平，且其脊髓病灶中的OPC的凋亡現(xiàn)象有所緩解。提示AST細(xì)胞上CLU的敲除可能具有髓鞘保護(hù)效應(yīng)（圖6、圖7）。
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△圖6? CLU敲低可增強(qiáng)LPC導(dǎo)致的胼胝體脫髓鞘病灶的髓鞘再生
△圖7? 敲除AST中CLU可減輕EAE發(fā)病程度及病灶內(nèi)OPC的損傷
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本研究揭示了AST在病理免疫狀態(tài)下（如MS/EAE）促進(jìn)CLU表達(dá)，CLU通過作用于OPC的VLDLR受體，抑制Pi3k-Akt通路，最終損傷OPC和阻礙髓鞘再生的關(guān)鍵機(jī)制。同時，該研究闡明了，MS中髓鞘損傷及再生受阻的新機(jī)制，為MS預(yù)后判斷提供了新的生物標(biāo)記物，同時為MS治療提供了全新的靶點(diǎn)和方向。
△圖8? MS/EAE中星膠“發(fā)炎”，抑制髓鞘再生
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研究團(tuán)隊
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通訊作者
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第一作者
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我院腦病中心邱偉、舒崖清、湯常永團(tuán)隊近年來一直致力于神經(jīng)免疫病中不同膠質(zhì)細(xì)胞的功能互作及其靶向治療策略?（圖9）。團(tuán)隊近期在Nature Communications（2024）、Cell Reports（2024a，2024b）、Science Advances（2023）、Molecular Therapy（2023）、ACS Nano（2022）、Glia（2022）、Clinical and Translational Medicine（2022）、Neurobiology of Disease（2024）、Molecular Neurobiology（2023）、Neuroscience Bulletin（2019）等國際期刊發(fā)表系列原創(chuàng)性神經(jīng)免疫病論文。本研究在星形膠質(zhì)細(xì)胞功能機(jī)制上，取得了新的進(jìn)展，為神經(jīng)免疫病的機(jī)制研究提供了新思路。
△圖9? 神經(jīng)免疫病膠質(zhì)細(xì)胞互作研究總結(jié)圖
